摘要
气喘是国际认定的呼吸道慢性发炎疾病之一。于本篇研究中，进一步的去研究益生菌在抗体刺激试验中的影响（利用卵清蛋白(OVA)引发 BALB/c老鼠的气喘）。在抗原刺激试验前先给予小鼠喂食 唾液乳杆菌L. salivarius PM-A0006，在刺激试验后分别分析：血中 OVA抗体的浓度、呼吸道对乙酰甲胆碱的反应、肺部的发炎细胞、支气管肺泡灌洗出以及脾脏中细胞激素的含量。结果显示喂食小鼠活的 唾液乳杆菌L. salivarius PM-A0006可显著降低呼吸道中嗜酸性白血球的浓度，并减少血中 OVA特异性抗体含量；另外，唾液乳杆菌L. salivarius PM-A0006亦可减少呼吸道过敏反应的发生并可提升 IFN-γ含量。
由结果可知，食用唾液乳杆菌 L. salivarius PM-A0006益生菌对于过敏性哮喘具有治疗的效果。

前言
气喘是一种慢性气道疾病，其特征是可逆的气道炎症、阻塞、过度反应，并提高 IgE生产和粘液分泌。与气管浸润程度有关的炎症细胞，如嗜酸性粒细胞，淋巴细胞和肥大细胞，反映了气喘的严重度。几种发炎介质会促进气喘的进展，如 PGE2，LTC4和趋化因子。以往的研究表示， Th2细胞及其细胞因子在气喘发病机制中扮演重要的角色。因此，藉由加强 Th1细胞活性来向下调节 Th2的病理反应，受到极大的重视。益生菌由联合国粮食及农业组织定义为 ''活的微生物，其中，当消耗数量充足，会带给宿主健康的益处''。在众多乳酸菌的益生菌作用，他们的免疫调节作用一直是被最广泛的研究。最近的研究报告指出，乳酸菌可减少人类和小鼠的过敏反应，益生菌居住在宿主的胃肠道可以诱导 Th1细胞的抗过敏反应。
此外，Th2细胞引起的过敏性炎症也可以被益生菌诱发产生的 TGF-b所抑制。虽然许多研究已经证实，用益生菌处理过敏症状是有益的，然而口服益生菌处理呼吸道过敏是否具有疗效仍是未定的。
除了作用在肠道外，亦有证据显示，口服益生菌可能可以调节肺部的免疫反应。例如，康敏元抗过敏益生菌可以降低儿童呼吸道病毒感染的频率和严重程度。此外，研究证明了口服 唾液乳杆菌PM-A0006能显著提高肺自然杀伤细胞活性，并促进小鼠鼻腔淋巴细胞中 IFN -g和 TNF的产量。然而，作用及有效性又取决于不同的抗过敏益生菌。
本实验的目的在于试验唾液乳杆菌 L. salivarius对于用卵清蛋白诱发气喘的模式中是否会有影响。实验结果显示，唾液乳杆菌 L. salivarius在用卵清蛋白诱发气喘的模式中，不但可以减少抗原诱发产生的嗜酸性细胞流入呼吸道中，也可减少 methacholine所引起的细胞激素反应及过度反应。

材料与方法
实验动物
使用 BALB/c小鼠，6-8周大，雌鼠，每组只数至少 10只。选用常用的 BALB/c 雌鼠，8 周大，喂食六周，每组只数 14只。自台大动物中心购进 SPF六周大的 BALB/c雌鼠，每只小鼠分别饲养于不锈钢笼中，室温控制于 22±2℃，光暗循环时间各为 12 小时（早上六点亮，下午六点暗），自由摄食饮水及饲料，小鼠八周大时以体重随机分组，开始以管喂方式给予受测乳酸菌同时进行致敏。

建立呼吸道发炎动物模式
小鼠致敏步骤简述如下：实验开始第 2天以 50μg卵白蛋白 (OVA) 与佐剂 Alum 4mg腹腔注射至小鼠体内，于实验第 16、30、44 天再以 25μg之 OVA 与 4 mg Alum重复注射老鼠。致敏后，在实验第 54、55天，将小鼠麻醉，以鼻腔内 (intra-nasal, i.n.) 滴入 100 μg OVA 之方式诱发呼吸道发炎反应。

益生菌喂食
由宁波绿康康复科技股份有限公司提供之康敏元益生菌中所含的唾液乳杆菌 Lactobacillus salivarius PM-A0006，每天以喂食针（18 gauge, 5 cm 钢管）管喂方式，直接将乳酸菌管喂至小鼠胃内。每天口服一次。试验剂量低剂量组：每天管喂 0.5 mL含 0.079 mg（~ 3.95 mg/kg鼠体重）0.5 倍建议剂量，中剂量组：每天管喂 0.5 mL 含 0.158 mg（~ 7.9 mg /kg 鼠体重）1 倍建议剂量，高剂量组：每天管喂 0.5 mL含 0.79 mg （~ 39.5 mg/kg 鼠体重）5 倍建议剂量，对照组为每天同样以管喂操作，管喂同体积 0.5 ml 的无菌蒸馏水。

测定血清中 OVA 专一性抗体，IgE,IgG1,以及 IgG2a
将0.5mg抗原溶于 100μL carbonate coating buffer (0.1 M NaHCO3) 加入微量培养盘于 4℃静置过夜。第 2天以含有 0.05% Tween 20之 1X PBS缓冲液清洗微量培养盘。然后以 blocking solution (含有 1% BSA 之 1X PBS缓冲液)进行 blocking 两小时以上，清洗 3次后，接着加入 100μL 待测样本反应于 4℃ 静置过夜，清洗 4次后，加入 100μL 抗小鼠 IgE、IgG1或 IgG2a抗体于室温反应一至两小时，再清洗 5次。加入 100 μL经适当稀释之 avidin-HRP (avidin-horseradish peroxidase conjugated) 反应一小时，清洗 6次，最后加入 100 μL ABTS ( 2.2'-Azino- bis-3- Ethylbenzthiazoline -6-Sulfonic Acid) 受质溶液于室温呈色约 30分钟后，以 100 μL 之 5% SDS终止反应，并以 microplate reader读取吸光值。测定结果以 ELISA unit方式表示如下：
ELISA unit = (Asample－Ablank) / (Apositive control－Ablank)

呼吸道过度反应 (airway hyperresponsiveness, AHR)
为研究口服抗过敏乳酸菌是否能减缓致敏小鼠之过敏反应，在两次气管内过敏原刺激后，隔天接受呼吸道阻力的测试。测试系统为 Buxco system (Biosystem XA, Buxco Electronics Inc. Sharon, CT, USA)。利用系统中的 transducer (differential pressure transducer, Buxco) 及 preamplifier (MAX II, Buxco)收集小鼠呼吸道变化的讯息而计算出 Penh值。小鼠在意识清醒状态下置于 whole body plethysmograph chamber 中，以渐增浓度之 Methacholine (6.25、12.5、25、50 mg/mL) 喷雾化给予小鼠刺激，各浓度皆在刺激三分钟后，再记录三分钟之呼吸道生理变化。记录三分钟内各分钟平均 Penh值。

肺冲洗液
测试完肺呼吸阻力隔天，小鼠进行牺牲，剪开颈部皮肉使气管露出，以静脉置留管插入气管，第一次先以 1 mL 无菌 HBSS buffer冲洗肺部，第二及第三次则以含有 2% BSA之 HBSS buffer 冲洗肺部，首次取得之肺冲洗液经 1500 rpm 离心 5分钟后，分离上清液保存于 -80℃ 待后续分析。细胞部分则并入后两次肺冲洗液中，以 1500 rpm 离心 5分钟，弃置上清液后并将细胞以 1mL含有 2% BSA之 HBSS buffer悬浮，并以 trypan blue染色计数，取约 1× 105之细胞以 cytospin 500 rpm 离心 3分钟制作细胞抹片，待其自然风干后，依序以 Liu A及 Liu B染色，以少量阿拉伯胶封片，使用油镜 (1000 x) 判读至少五个视野之细胞或总数 300 个以上之细胞，计算其中淋巴球及多核球比例。

图 1.实验步骤：喂食益生菌以及 OVA致敏化。小鼠在第 2,16,30,以及 44天时以 OVA致敏，小鼠以注射针强迫喂食冻干 Lactobacillus salivariusPM -A0006菌粉连续 8个星期来挑战抗原。以蒸馏水灌胃无致敏的小鼠做为负控制组，经 OVA致敏小鼠没有喂食益生菌组作为正控制组。二十四小时后到最后的挑战（55日），来测量小鼠的呼吸道反应。

肺冲洗液发炎介质
从肺冲洗液分离细胞，上清液储存在 -80℃以便分析发炎介质。发炎介质前列腺素 E2(PGE2)、白三烯 C4(LTC4)和嗜酸性白血球激素(eotaxin)评估以 ELISA试剂盒（R＆D系统有限公司，牛津大学，英国）。

体外细胞激素测量
测量上清液中 IFN - g和 IL - 5过敏原的重复刺激。分离所有脾脏细胞和培养在 24孔平底板，37℃，5％CO2培养箱。5×106样本细胞以 CON A刺激，总体积为 1毫升。48小时后，收集细胞上清液以 ELISA评估 IFN – g和 IL
- 5的水平。

统计方法
实验结果以平均值 ±标准误差表示 (Means ± SEMs)。各组间差异以 Student t-test 分析，p < 0.05 视为有显著差异 (*, p <0.05; **, p < 0.001)。

试验结果
测定 OVA 专一性抗体的 ELISA结果
血清中 OVA 特异性抗体效价部分，随着喂食剂量增加， OVA致敏小鼠血清中的 OVA 特异性 IgE抗体有显著减少的差异(图 2)。而 OVA 特异性 IgG1 与 IgG2a则在三组实验组与对照组之间皆无差异(结果未附上)。

图 2. 服用益生菌的 OVA致敏小鼠血清特异性 IgE产生的结果。各组小鼠牺牲后获得血清，使用 ELISA确认最后 IgE水平。数据显示为平均值±标准差（每组= 10-14）。＊星号表示对对照组而言益生菌治疗组有显著差异（*p值＜
0.05）。
呼吸道反应-对 methacholine
利用 methacholine刺激 OVA致敏动物产生增加呼吸反应，了解在致敏情况下呼吸道相关反应之研究，将 methacholine诱导呼吸道过度反应之 OVA致敏小鼠口服喂食 L. Salivarius PM-A0006，使用全身呼吸系统评估肺功能。实验结果指益生菌组可抑制降低呼吸过度之反应，而且发现在低剂量之组别效果最好。(图3)

图 3.喂食 Lactobacillus salivarius PM-A0006在高浓度 Methacholine刺激下肺呼吸阻力测定结果。体内试验呼吸道反应以 whole body plethysmograph计算肺呼吸阻力值(Penh)。数据以平均值±标准差 (n=10-14，每组小鼠 )表示，＊星号表示对于对照组和益生菌治疗组的显著差异(*, p< 0.05; **, p< 0.01)。

发炎细胞注入呼吸道结果分析
刺激 OVA致敏动物会导致肺冲洗液中总细胞数增加，实验结果显示口服喂食 L. salivariusPM-A0006与正控制组比较下，肺冲洗液中总细胞数有轻微下降，但未有显著差异(图.4A)。在肺冲洗液中细胞分布(淋巴细胞 lymphocytes、巨噬细胞 macrophages、中性球 neutrophils和嗜伊红血球 eosinophils)。结果显示出巨噬细胞大量的产生，而在 OVS刺激下也导致嗜伊红血球之数量有显著提高(图.4B)。在口服喂食 L. salivariusPM-A0006不同剂量结果显示，益生菌组之嗜伊红血球产生之比率低于正控制组(图.4B)。

图 4.喂食 Lactobacillus salivariusPM-A0006的肺冲洗液细胞分布结果，从 OVA致敏小鼠 24小时后连续喂食 8周的总细胞数量(A)以及(B)差异细胞计数 (macrophages, eosi-nophils, neutrophils, and lymphocytes)结果。数据以平均值±标准差(n=10-14，每组小鼠 )表示，＊星号表示对于对照组和益生菌治疗组的显著差异(*, p< 0.05; **, p< 0.01)。

肺冲洗液发炎介质分析结果
有几种发炎介质会促使气喘之发生，如前列腺素 E2(PGE2)、白三烯 C4(LTC4)和嗜酸性白血球激素(eotaxin) (Cohn et al.2004).。利用 ELISA进一步检测各种发炎介质。在图 5中，OVA刺激小鼠口服喂食 L. salivarius PM-A0006组别中，嗜酸性白血球激素 (eotaxin)表现量都有下降。此外发现喂食低剂量组有显著下降（图.5）。而控制组和益生组在前列腺素 E2(PGE2)和白三烯 C4(LTC4)部分则无任何差异。

脾脏细胞培养之细胞激素分析
现在普遍了解当过敏疾病产生是因为 Th1/Th2失衡，而往 Th2反应进行。。因此，提高 Th1反应是一种治疗哮喘症状主要模式（(Suzuki et al. 2001）。进一步研究使用口服喂食 L. Salivarius PM-A0006治疗 OV-致敏小鼠，是否影响 Th1/Th2的平衡。实验结果显示，在低剂量组治疗中，IFN-γ表现量有明显提高（ Fig.6.）。而测试 IL-5表现量，控制组和益生组则无任何差异，结果并未附上。

讨论

图 5. OVA致敏小鼠喂食 Lactobacillus salivarius PM-A0006后肺部炎症传递 (eotaxin, LTC4, and PGE2)肺冲洗液的 ELISA分析结果。数据以平均值±标准差(n=10-14，每组小鼠 )表示，＊星号表示对于对照组和益生菌治疗组的显著差异(*, p< 0.05; **, p< 0.01)。

图 6. 喂食 Lactobacillus salivariusPM-A0006后提升脾脏细胞 IFN-g分泌量。BALB小鼠连续喂食蒸馏水或 Lactobacillus salivarius PM-A0006共 8周，在 8周里比较脾脏细胞的单核细胞。脾脏细胞经 ConA刺激培养后收集浮在表层的脾脏细胞，再以 ELISA确认细胞激素。数据以平均值±标准差 (n=10-14，每组小鼠 )表示，＊星号表示对于对照组和益生菌治疗组的显著差异 (*, p< 0.05; **, p< 0.01)。

许多的证据支持了益生菌类似乳酸菌对于肠道免疫系统产生巨大的刺激作用。因此乳酸菌和其它益生菌微生物已被证实可以有效地管理过敏性疾病，例如：鼻炎、过敏性皮肤炎和气喘。此外 Kruisselbrink (2001)和其团队提供了临床证据指出益生菌治疗是有效的预防过敏原引起的过敏性皮肤炎的方法。在之前的研究中卵白蛋白刺激小鼠气管发炎动物模式已经常被使用来研究评估口服益生菌对于过敏原引起的气喘气管反应的影响。我们的实验结果证实了口服 L. salivarius PM-A0006在致敏之前和致敏期间刺激气管后，发现了气喘表现的许多病征有被抑制。包括特异性 IgE抗体产生、气管发炎和呼吸道过度反应。肺冲洗液细胞数和呼吸道过度反应降低和肺冲洗液中发炎细胞激素浓度降低有关。除此之外，口服 L. salivarius PM-A0006 可以提升 Th1调节的细胞激素干扰素-γ(IFN-g)。其它的研究成果已经被报导出相似乳酸菌抗发炎的研究。口服 L. rhamnosus GG抑制呼吸道反应 (Blu¨mer,2007; Feleszko, 2007; Karimi, 2009; Hougee, 2010)，降低过敏原特异性 IgE抗体产生 (Feleszko, 2007; Hougee, 2010)，降低嗜伊红血球聚集(Blu¨mer, 2007;Karimi, 2009)以及减弱呼吸道过度反应现象(Karimi, 2009)。由此可知，调节性 T细胞在调节 Th2细胞对于过敏原的反应中扮演一个重要的角色，维护功能上性和抑制过敏原引起的呼吸道过度反应(Strickland, 2006)。之前的研究指出 L. rhamnosus GG促进调节性 T细胞保护对抗过敏性呼吸道藉由降低呼吸道过度反应、降低特异性 IgE产生和降低嗜伊红血球聚集 (Karimi, 2009; Lyons, 2010)。我们猜测 L. salivarius PM-A0006抑制过敏性呼吸道反应可能和调节性 T细胞活性有关。

Forsythe (2007)分析口服益生菌 L. salivarius在抗过敏性呼吸道发炎的小鼠模式中对于过敏性呼吸道发炎的影响。观察此益生菌菌种依赖性的特征和实验结果反映出口服 L. salivarius治疗并不会调节过敏性呼吸道反应。乳酸菌抗过敏影响具有菌种依赖性且维持 Th1/Th2细胞激素的表现和平衡。Forsythe (2004)从卵白蛋白致敏小鼠上分离脾脏细胞分析超过 100种乳酸菌所诱导出的细胞激素，发现到是乳酸菌菌株会刺激产生不同的细胞激素数据，而不是取决于品种。

其它的研究反应出在呼吸道提升过敏原诱导的 Th2型细胞激素产生会提升 IgE抗体的形成和嗜伊红血球浸润的呼吸道发炎 (Shi, 1997)。这些过敏性呼吸道反应可以藉由 Th1细胞激素例如干扰素-γ和 IL18被抑制住 (Wohlleben和 Erb, 2002)。在我们的研究中口服 L. salivariusPM-A0006在卵白蛋白诱导之前和期间发现到细胞激素的分泌由 Th2转变成 Th1。此外在这里评估不同浓度的益生菌在卵白蛋白致敏小鼠动物模式上对抗过敏原的挑战。虽然没有观察到伴随浓度而改变的影响，根据气喘的主要特征，口服低剂量(0.5x, 2.6x 10 6 CFU/day)的 L. salivarius PM-A0006可能镇压住。益生菌的确切剂量必须进一步确定。两个相关的研究报告出在卵白蛋白挑战下使用 L. salivarius (1~2 x 109 CFU/day)不会改变 IgE的产生和嗜酸性粒细胞的聚集 (Karimi, 2009; Lyons, 2010)。我们猜测使用低剂量的 L. salivarius可能结果在抗发炎的影响，而且 Drago (2010)指出 L. salivarius一样菌种的不同菌株有不同调节 Th1或 Th2型免疫反应的影响。根据这些理由，选择适当的益生菌和精确的浓度似乎使的关注的议题为了基础研究和临床应用。

在结论中我们证实了口服抗过敏益生菌活菌制剂康敏元益生菌唾液乳杆菌：L. salivarius PM-A0006结果有明显的减缓过敏性呼吸道反应。我们的实验结果指出口服 L. salivarius PM-A0006可以减缓过敏原引起的气喘呼吸道反应，包括呼吸道浸润的嗜伊红血球数目减少，过敏原所引起的 Th2反应转变为 Th1反应，和阻止对于 methacholine的过度反应。在这些利益影响之下，我们因此得出结论，康敏元益生菌唾液乳杆菌L. salivarius PM-A0006是一种很有前瞻性的候选菌株，可以用来更进一步的研究过敏性呼吸道疾病的来龙去脉。